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Breitling
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Prof. Dr. Frank Breitling
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Peptidarrays und Antikörperbibliotheken

Unsere Forschungsprojekte lassen sich in zwei Arbeitsbereiche aufteilen: (1) Die kombinatorische Synthese von hochdichten Peptidarrays mit Hilfe von Aminosäurenpartikeln (in Zusammenarbeit mit der DKFZ-Arbeitsgruppe Chipbasierte Peptidbibliotheken und unserer Ausgründung PEPperPRINT) und (2) die Herstellung einer Bibliothek von >105 verschiedenen menschlichen Hybridomen (mehr) mit der die Suche nach monoklonalen Antikörpern deutlich beschleunigt und vereinfacht werden soll (in Zusammenarbeit mit Dr. Gerhard Moldenhauer aus der DKFZ-Abteilung Translationale Immunologie).

Forschung

Hochdichte Peptidarrays

Peptidarrays wurden von Dr. Ronald Frank erfunden [1], indem er die mit dem Nobelpreis ausgezeichnete Festphasen gekoppelte Peptidsynthese [2; Bruce Merrifield, Nobelpreis für Chemie in 1984] parallelisiert hat. Dazu werden die 20 verschiedenen Aminosäurederivate in einem Lösungsmittel auf definierte Spots eines aminoterminierten Trägers aufgebracht und somit Schicht für Schicht viele Peptide in einer kombinatorischen Synthese (Abb. 1) nebeneinander aufgebaut (www.helmholtz-hzi.de/de/forschung/vorsorge_und_therapie/chemische_biologie). Ein Nachteil dieser „SPOT Synthese“ ist jedoch, dass damit bisher nur ~25 Peptide pro cm2 synthetisiert werden können. Dies liegt daran, dass kleine Flüssigkeitströpfchen sehr schwer zu dosieren sind, dass die benötigten viskosen Lösungsmittel an der Oberfläche entlang „kriechen“, und dass diese Tröpfchen während der Kopplungsreaktion längere Zeit nicht verdunsten dürfen.

Um diese technischen Schwierigkeiten zu umgehen, haben wir ein neues preisgekröntes [3, 4] Verfahren entwickelt, bei dem die Aminosäurederivate zunächst in festen elektrisch aufladbaren „Aminosäurepartikeln“ eingebettet werden. Diese Partikel werden anschließend entweder mit einem modifizierten Laserdrucker [5], oder durch die elektrischen Felder eines Computerchips [6] an sehr kleine Orte auf einer zweidimensionalen Oberfläche „versendet“. Nach dem ablagern der unterschiedlichen Partikelsorten wird schließlich die Kopplungsreaktion gestartet indem die ganze Partikellage einfach geschmolzen wird. Dies befreit die zuvor in der Festsubstanz immobilisierten Aminosäuren, sodass sie zu der Trägeroberfläche diffundieren können wo sie mit den dortigen Aminogruppen abreagieren (Abb. 2). Ein technischer Vorteil ist dabei, dass sich die geschmolzenen Partikel auf Grund der Oberflächenspannung zu sehr kleinen Halbkugeln zusammenziehen mit entsprechend kleinen Syntheseorten (siehe Abb. 4F, Chipdrucker) (mehr). Mit diesem Verfahren konnten wir den Stand der Technik bisher ~20-fach verbessern was die Zahl der Peptide pro Fläche betrifft und ~100-fach was die Kosten pro Peptid betrifft. Ein „Peptidlaserdrucker“ (Abb. 3) der zweiten Generation wird derzeit von unseren Kooperationspartnern Fraunhofer IPA und KMS Automation im Rahmen des EU FP7 Projektes PEPLASER (mehr) entwickelt. Mit dieser Maschine wollen wir bis Mitte 2010 den Stand der Technik auf dann >500.000 Peptide pro 20x20 cm2 verbessern. Damit werden vollkommen neue Anwendungen für Peptidarrays (mehr) erstmals möglich [7].

Alternativ zu einem Laserdrucker kann auch ein CMOS Chip mit einem Array von Pixelelektroden direkt unter der Oberfläche des Chips für die Adressierung der Aminosäurepartikel und die nachfolgende kombinatorische Peptidsynthese verwendet werden. Mit diesem Chip-basierten Verfahren, das federführend von PD Dr. Alexander Nesterov-Müller betreut wird konnten wir bisher 40.000 Peptide pro cm2 herstellen [6 und Abb. 4]. In Kooperation mit dem Institut für Druckmaschinen und Druckverfahren der Technischen Universität Darmstadt (Prof. Dr.-Ing. Edgar Dörsam) und dem Kirchhoff Institut für Physik der Universität Heidelberg (Prof. Michael Hausmann) entwickeln wir derzeit einen „Chipdrucker“ (mehr), der voraussichtlich ab 2011 für die routinemäßige Herstellung von sehr dichten Peptidarrays genutzt werden soll. Ziel dieser Entwicklungsarbeiten soll ein Verfahren sein, mit dem bis zum Jahr 2012 eine Million frei wählbare Peptide in guter Qualität für wenige Euro Chemikalienkosten auf einem Glasobjektträger synthetisiert werden können. Damit werden vollkommen neue Anwendungen für Peptidarrays (mehr) erstmals möglich.


Abb. 1; Dargestellt ist die Verlängerung von Oligomeren um einen weiteren Monomerbaustein durch kombinatorische Synthese. Mit wenigen unterschiedlichen Bauelementen kann eine sehr große Vielzahl von Oligomeren hergestellt werden. Die 4 Nukleotid-Bausteine der DNA ergeben für n-mere Türme 4n Möglichkeiten. Die 20 Aminosäure-Bausteine von Peptiden ergeben für n-mere Türme 20n Möglichkeiten.

 


Abb. 2; Kombinatorische Synthese eines Peptidarrays mit einem Laserdrucker.

 


Abb. 3; Peptidlaserdrucker mit einem Muster von an den Träger gekoppelten Aminosäuren.

 


Abb. 4; Partikelbasierte kombinatorische Synthese von Peptidarrays. A, E: geladene Aminosäure Partikel werden auf individuell wählbaren Pixelelektroden abgelagert B: 20 verschiedene Aminosäure Partikel sind ortsgenau abgelagert worden C, F: Geschmolzene Aminosäure Partikel ermöglichen es Fmoc-Aminosäure OPfp Estern zur Oberfläche des Trägers zu diffundieren und dort mit freien Aminogruppen des Trägers abzureagieren F, G: Wiederholte Kopplungszyklen ergeben die kombinatorische Synthese eines Peptidarrays.

 

[1] Frank R. (1992) Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron 48, 9217-9232.

[2] Felgenhauer T, Schirwitz C und Breitling F. (2010) Peptide synthesis. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Last updated: 29 Apr 2010) published online 10.1002/14356007.a19_157.pub2

[3] Stadler V, Bischoff FR, Felgenhauer T, Kring M und Breitling F. Gewinn des mit 30.000 € dotierten 1. Platz im bundesweiten Businessplan-Wettbewerb „Science4Life“ mit dem Projekt Fertigung und Vertrieb von Biochips zur Parallel-Synthese unterschiedlicher Peptide (Juni 2009).

[4] Breitling F, Bischoff FR, Stadler V, Felgenhauer T, Leibe K, Fernandez S (alle DKFZ bzw. KIT) und Güttler S, Gröning M, Willems P, Biesinger B (Fraunhofer IPA). Gewinn des mit 50.000 € dotierten Wissenschaftspreises des Stifterverbandes mit dem Projekt Peptid-Laserdrucker (Mai 2008).

[5] Stadler V, Felgenhauer T, Beyer M, Fernandez S, Leibe K, Güttler S, Gröning M, Torralba G, Lindenstruth V, Nesterov A, Block I, Pipkorn R, Poustka A, Bischoff FR und Breitling F. (2008) Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer Angew. Chem. Int. Ed. 47, 7132–7135.

[6] Beyer M, Nesterov A, Block I, König K, Felgenhauer T, Fernandez S, Leibe K, Torralba G, Hausmann M, Trunk U, Lindenstruth V, Bischoff FR, Stadler V und Breitling F. (2007) Combinatorial synthesis of peptide arrays onto a computer chip’s surface. Science 318, 1888.

[7] Breitling F, Nesterov A, Stadler V, Felgenhauer T und Bischoff FR. (2010) High-density peptide arrays. Molecular BioSystems 5, 224-234. Epub 2009 Jan 16. Review